Хроматографияи моеъ усули асосии санҷиши таркиби ҳар як ҷузъ ва ифлосиҳо дар ашёи хом, мобайнӣ, омодагӣ ва масолеҳи бастабандӣ мебошад, аммо бисёр моддаҳо усулҳои стандартӣ барои такя кардан надоранд, бинобар ин таҳияи усулҳои нав ногузир аст. Ҳангоми таҳияи усулҳои фазаи моеъ, сутуни хроматографӣ асосии хроматографияи моеъ мебошад, бинобар ин, чӣ гуна интихоб кардани сутуни хроматографии мувофиқ муҳим аст. Дар ин мақола, муаллиф мефаҳмонад, ки чӣ тавр интихоб кардани сутуни хроматографияи моеъ аз се ҷиҳат: ғояҳои умумӣ, мулоҳизаҳо ва доираи татбиқ.
A. Идеяҳои умумӣ барои интихоби сутунҳои хроматографияи моеъ
1. Арзёбии хосиятҳои физикӣ ва химиявии моддаҳои таҳлилшаванда: ба монанди сохтори кимиёвӣ, ҳалшавандагӣ, устуворӣ (масалан, оксид шудан/ кам кардан/гидролиз кардан осон аст), туршӣ ва ишқорӣ ва ғайра, махсусан сохтори кимиёвӣ калид аст омили муайян кардани хосиятҳо, ба монанди гурӯҳи conjugated дорои азхудкунии ултрабунафш қавӣ ва флуорессенсия қавӣ;
2. Мақсади таҳлилро муайян кунед: оё ҷудокунии баланд, самаранокии баланди сутун, вақти кӯтоҳи таҳлил, ҳассосияти баланд, муқовимати фишори баланд, мӯҳлати дарозии сутун, арзиши кам ва ғайра зарур аст;
- Сутуни хроматографии мувофиқро интихоб кунед: таркиб, хосиятҳои физикӣ ва химиявии пуркунандаи хроматографиро фаҳмед, ба монанди андозаи зарраҳо, андозаи сӯрохиҳо, таҳаммулпазирии ҳарорат, таҳаммулпазирии рН, адсорбсияи таҳлилшаванда ва ғайра.
- Мулоҳизаҳо барои интихоби сутунҳои хроматографияи моеъ
Дар ин боб омилҳое баррасӣ мешаванд, ки ҳангоми интихоби сутуни хроматография аз нуқтаи назари хосиятҳои физикӣ ва химиявии худи сутуни хроматография ба назар гирифта шаванд. 2.1 Матритсаи пуркунанда
2.1.1 Матритсаи силикагель Матритсаи пуркунандаи аксари сутунҳои хроматографияи моеъ силикагел мебошад. Ин навъи пуркунанда дорои тозагии баланд, арзиши паст, қувваи баланди механикӣ мебошад ва барои тағир додани гурӯҳҳо осон аст (ба монанди пайванди фенил, аминокислотаҳо, пайванди сиано ва ғайра), аммо арзиши рН ва диапазони ҳарорати он маҳдуд аст: Диапазони рН-и аксари пуркунандаҳои матритсаи силикагел аз 2 то 8 аст, аммо диапазони рН фазаҳои ба таври махсус тағйирёфтаи силикагели пайвастшуда метавонад ба андозаи васеъ бошад. 1,5 то 10 ва инчунин фазаҳои махсусгардонидашудаи силикагели бонд мавҷуданд, ки дар рН паст устуворанд, ба монанди Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, ки дар pH 1 то 8 устувор аст; ҳадди ҳарорати болоии матритсаи силикагель одатан 60 ℃ аст ва баъзе сутунҳои хроматография метавонанд ҳарорати 40 ℃ дар рН баландро таҳаммул кунанд.
2.1.2 Матритсаи полимерӣ Пуркунандаҳои полимерӣ асосан полистирол-дивинилбензол ё полиметакрилат мебошанд. Бартарии онҳо дар он аст, ки онҳо метавонанд диапазони васеи рН-ро таҳаммул кунанд - онҳо метавонанд дар доираи аз 1 то 14 истифода шаванд ва онҳо ба ҳарорати баланд тобовартаранд (метавонад аз 80 ° C боло равад). Дар муқоиса бо пуркунандаҳои кремнийи C18, ин навъи пуркунанда дорои гидрофобияти қавитар аст ва полимери макропорус дар ҷудо кардани намунаҳо ба монанди сафедаҳо хеле самаранок аст. Камбудиҳои он дар он аст, ки самаранокии сутун пасттар аст ва қувваи механикӣ нисбат ба пуркунандаҳои кремний заифтар аст. 2.2 Шакли зарраҳо
Аксари пуркунандаҳои муосири HPLC зарраҳои сферӣ мебошанд, аммо баъзан онҳо зарраҳои номунтазам мебошанд. Заррачаҳои сферикӣ метавонанд фишори пасти сутун, самаранокии баландтари сутун, устуворӣ ва умри дарозро таъмин кунанд; ҳангоми истифодаи фазаҳои мобилии дорои часпаки баланд (масалан, кислотаи фосфорӣ) ё вақте ки маҳлули намуна часпак аст, заррачаҳои номунтазам дорои масоҳати мушаххаси бештар доранд, ки барои амали пурраи ду фаза мусоидат мекунанд ва нарх нисбатан паст аст. 2.3 Андозаи заррачаҳо
Чӣ қадаре ки андозаи зарраҳо хурдтар бошанд, самаранокии сутун баландтар ва ҷудошавӣ ҳамон қадар баландтар аст, аммо муқовимати фишори баланд ҳамон қадар бадтар аст. Сутуни аз ҳама бештар истифодашаванда сутуни андозаи зарраҳои 5 мкм мебошад; агар талаботи ҷудокунӣ баланд бошад, пуркунандаи 1,5-3 мкм интихоб кардан мумкин аст, ки барои ҳалли масъалаи ҷудокунии баъзе матритсаҳои мураккаб ва намунаҳои бисёркомпонентӣ мусоид аст. UPLC метавонад пуркунандаи 1,5 мкм истифода барад; Пуркунандаҳои андозаи зарраҳои 10 мкм ё калонтар аксар вақт барои сутунҳои нимтайёрӣ ё омодагӣ истифода мешаванд. 2.4 Мазмуни карбон
Мазмуни карбон ба таносуби фазаи пайвастшуда дар сатҳи силикагель дахл дорад, ки ба майдони мушаххаси рӯизаминӣ ва фарогирии фазаи пайвастшуда алоқаманд аст. Мазмуни баланди карбон иқтидори баланди сутун ва ҳалли баландро таъмин мекунад ва аксар вақт барои намунаҳои мураккабе, ки ҷудокунии баландро талаб мекунанд, истифода мешавад, аммо аз сабаби дарозии ҳамкории байни ду марҳила, вақти таҳлил дароз аст; сутунҳои хроматографии дорои миқдори ками карбон вақти таҳлили кӯтоҳтар доранд ва метавонанд интихоби гуногунро нишон диҳанд ва аксар вақт барои намунаҳои оддӣ, ки таҳлили зуд ва намунаҳоеро талаб мекунанд, ки шароити фазаи баланди обиро талаб мекунанд, истифода мешаванд. Умуман, миқдори карбон дар C18 аз 7% то 19% аст. 2.5 Андозаи сӯрохҳо ва масоҳати мушаххаси рӯизаминӣ
Воситаҳои адсорбсияи HPLC зарраҳои ковок мебошанд ва аксари мутақобила дар сӯрохиҳо сурат мегиранд. Аз ин рӯ, молекулаҳо бояд ба сӯрохиҳо ворид шаванд, то адсорбсия ва ҷудо шаванд.
Андозаи сӯрохиҳо ва майдони мушаххаси рӯизаминӣ ду мафҳуми иловаги мебошанд. Андозаи хурди сӯрох маънои майдони калони мушаххаси рӯизаминиро дорад ва баръакс. Масоҳати калони мушаххаси рӯизаминӣ метавонад таъсири мутақобилаи молекулаҳои намуна ва фазаҳои пайвастшударо афзоиш диҳад, нигоҳдории онро афзоиш диҳад, боркунии намуна ва қобилияти сутун ва ҷудошавии ҷузъҳои мураккабро афзоиш диҳад. Пуркунандаҳои комилан ковокӣ ба ин намуди пуркунандаҳо мансубанд. Барои онҳое, ки талаботҳои баланди ҷудокунӣ доранд, тавсия дода мешавад, ки пуркунандаҳои дорои масоҳати калони мушаххаси рӯизаминӣ интихоб карда шаванд; майдони хурди мушаххаси рӯизаминӣ метавонад фишори бозгаштро коҳиш диҳад, самаранокии сутунро беҳтар кунад ва вақти мувозинатро коҳиш диҳад, ки барои таҳлили градиент мувофиқ аст. Пуркунандаҳои ядроӣ ба ин навъи пуркунандаҳо тааллуқ доранд. Дар заминаи таъмини ҷудокунӣ, тавсия дода мешавад, ки пуркунандаҳои дорои майдони мушаххаси хурд барои онҳое, ки ба самаранокии таҳлил талаботи баланд доранд, интихоб карда шаванд. 2.6 Ҳаҷми сӯрохиҳо ва қувваи механикӣ
Ҳаҷми сӯрохиҳо, ки бо номи "ҳаҷми сӯрохҳо" низ маълум аст, ба андозаи ҳаҷми холӣ барои як заррача ишора мекунад. Он метавонад қувваи механикии пуркунандаро хуб инъикос кунад. Қувваи механикии пуркунандаҳои ҳаҷми сӯрохиҳои калон нисбат ба пуркунандаҳои дорои ҳаҷми хурди сӯрохҳо каме заифтар аст. Пуркунандаҳои дорои ҳаҷми сӯрохиҳо аз 1,5 мл/г камтар ё баробар барои ҷудокунии HPLC истифода мешаванд, дар ҳоле ки пуркунандаҳо бо ҳаҷми сӯрохҳо аз 1,5 мл/г бештар барои хроматографияи истисноии молекулавӣ ва хроматографияи фишори паст истифода мешаванд. 2.7 Меъёри ҳадди аксар
Сарпӯшӣ метавонад қуллаҳои думдорро, ки дар натиҷаи таъсири мутақобилаи байни пайвастагиҳо ва гурӯҳҳои силанолҳои фошшуда ба вуҷуд омадаанд (ба мисли пайванди ионӣ байни пайвастагиҳои сілтӣ ва гурӯҳҳои силанол, қувваҳои ван дер Ваалс ва пайвандҳои гидрогенӣ байни пайвастагиҳои туршӣ ва гурӯҳҳои силанол) кам кунад, ба ин васила самаранокии сутун ва шакли қулларо беҳтар кунад. . Фазаҳои бастабандии бемаҳдуд нисбат ба фазаҳои бастабандишуда, махсусан барои намунаҳои қутбӣ интихоби гуногунро ба вуҷуд меоранд.
- Доираи татбиқи сутунҳои гуногуни хроматографияи моеъ
Дар ин боб доираи татбиқи намудҳои гуногуни сутунҳои хроматографияи моеъ тавассути баъзе ҳолатҳо тавсиф карда мешавад.
3.1 Сутуни хроматографии марҳилаи баръакс C18
Сутуни C18 сутуни марҳилаи баръакси маъмултарин аст, ки метавонад ба мундариҷа ва наҷосати аксари моддаҳои органикӣ ҷавобгӯ бошад ва ба моддаҳои қутби миёна, заиф қутбӣ ва ғайриқутбӣ татбиқ карда мешавад. Навъ ва мушаххасоти сутуни хроматографии C18 бояд мувофиқи талаботи мушаххаси ҷудокунӣ интихоб карда шаванд. Масалан, барои моддаҳое, ки талаботҳои баланди ҷудокунӣ доранд, аксар вақт хусусиятҳои 5 мкм * 4,6 мм * 250 мм истифода мешаванд; барои моддаҳое, ки матритсаҳои мураккаби ҷудокунӣ ва қутбияти шабеҳ доранд, 4 мкм*4,6 мм*250 мм ё андозаи зарраҳои хурдтарро истифода бурдан мумкин аст. Масалан, муаллиф сутуни 3 мкм * 4,6 мм * 250 мм-ро барои ошкор кардани ду ифлосии генотоксикӣ дар селекоксиб API истифода бурд. Ҷудошавии ду модда метавонад ба 2,9 расад, ки ин аъло аст. Илова бар ин, дар зери заминаи таъмини ҷудокунӣ, агар таҳлили фаврӣ лозим бошад, сутуни кӯтоҳи 10 мм ё 15 мм аксар вақт интихоб карда мешавад. Масалан, вақте ки муаллиф LC-MS/MS-ро барои муайян кардани ифлосии генотоксикӣ дар API фосфати пиперакин истифода бурд, сутуни 3 мкм * 2,1 мм * 100 мм истифода шудааст. Ҷудоӣ байни наҷосат ва ҷузъи асосӣ 2,0 буд ва ошкор кардани намунаро дар 5 дақиқа анҷом додан мумкин аст. 3.2 Сутуни фенилҳои баръакс
Сутуни фенил инчунин як намуди сутуни марҳилаи баръакс мебошад. Ин навъи сутун барои пайвастагиҳои хушбӯй интихоби қавӣ дорад. Агар вокуниши пайвастагиҳои хушбӯй, ки бо сутуни оддии C18 чен карда мешаванд, заиф бошад, шумо метавонед иваз кардани сутуни фенилро баррасӣ кунед. Масалан, вақте ки ман селекоксиб API-ро месозам, вокуниши асосии ҷузъҳо аз ҷониби сутуни фенили ҳамон як истеҳсолкунанда ва ҳамон мушаххасот (ҳама 5 мкм * 4,6 мм * 250 мм) аз сутуни C18 тақрибан 7 маротиба чен карда шуд. 3.3 Сутуни марҳилаи муқаррарӣ
Ҳамчун иловаи муассир ба сутуни марҳилаи баръакс, сутуни марҳилаи муқаррарӣ барои пайвастагиҳои хеле қутбӣ мувофиқ аст. Агар қуллаи ҳалкунанда ҳангоми ҷӯшидан бо зиёда аз 90% фазаи обӣ дар сутуни марҳилаи баръакс хеле зуд бошад ва ҳатто ба қуллаи ҳалкунанда наздик бошад ва бо қуллаи ҳалкунанда мувофиқат кунад, шумо метавонед иваз кардани сутуни фазаи муқаррариро баррасӣ кунед. Ин навъи сутун сутуни хилӣ, сутуни амин, сутуни сиано ва ғайраро дар бар мегирад.
3.3.1 Сутуни Хилик Сутуни Хилик одатан гурӯҳҳои гидрофиликиро дар занҷири алкилии пайвастшуда барои баланд бардоштани аксуламал ба моддаҳои қутбӣ ҷойгир мекунад. Ин навъи сутун барои таҳлили моддаҳои қанд мувофиқ аст. Муаллиф ин навъи сутунро ҳангоми таҳияи мундариҷа ва моддаҳои алоқаманди ксилоза ва ҳосилаҳои он истифода кардааст. Изомерҳои ҳосилаи ксилозаро низ хуб ҷудо кардан мумкин аст;
3.3.2 Сутуни аминокислотаҳо ва сутуни сиано Сутуни аминокислотаҳо ва сутуни сиано ба ворид кардани тағиротҳои аминокислотаҳо ва сиано дар охири занҷири алкилии пайваст мутаносибан барои беҳтар кардани интихоби моддаҳои махсус ишора мекунанд: масалан, сутуни аминокислотаҳо интихоби хуб аст барои ҷудо кардани қандҳо, аминокислотаҳо, асосҳо ва амидҳо; сутуни cyano ҳангоми ҷудо кардани моддаҳои сохтории гидрогеншуда ва гидрогеннашуда аз сабаби мавҷудияти пайвандҳои конъюгатсионӣ интихоби беҳтар дорад. Сутуни аминокислотаҳо ва сутуни сиано аксар вақт метавонанд байни сутуни фазаҳои муқаррарӣ ва сутуни фазаи баръакс иваз карда шаванд, аммо ивазкунии зуд-зуд тавсия дода намешавад. 3.4 Сутуни хиралӣ
Сутуни хиралӣ, тавре ки аз ном бармеояд, барои ҷудо кардан ва таҳлили пайвастагиҳои хиралӣ, махсусан дар соҳаи дорусозӣ мувофиқ аст. Ин намуди сутунро вақте баррасӣ кардан мумкин аст, ки сутунҳои анъанавии баръакс ва сутунҳои фазавӣ ба ҷудошавии изомерҳо ноил шуда наметавонанд. Масалан, муаллиф барои ҷудо кардани ду изомерҳои 1,2-дифенилэтилендиамин: (1S, 2S)-1, 2-дифенилэтилендиамин ва (1R, 2R)-1, 2 сутуни хиралии 5 мкм*4,6 мм*250 мм истифода кардааст. -дифенилэтилендиамин ва ҷудошавии байни ҳарду тақрибан ба 2,0 расид. Аммо, сутунҳои хиралӣ нисбат ба дигар намудҳои сутунҳо гаронтаранд, одатан 1W+/piece. Агар ба ин гуна сутунхо эхтиёч ба вучуд ояд, звено бояд сметаи кофй тартиб дихад. 3.5 Сутуни мубодилаи ионхо
Сутунҳои мубодилаи ионҳо барои ҷудо кардан ва таҳлили ионҳои заряднок, аз қабили ионҳо, сафедаҳо, кислотаҳои нуклеинӣ ва баъзе моддаҳои қанд мувофиқанд. Аз рӯи намуди пуркунанда онҳо ба сутунҳои мубодилаи катионҳо, сутунҳои мубодилаи анионӣ ва сутунҳои мубодилаи катионҳои қавӣ тақсим мешаванд.
Сутунҳои мубодилаи катионҳо сутунҳои калтсий ва гидрогенро дар бар мегиранд, ки асосан барои таҳлили моддаҳои катионӣ ба монанди аминокислотаҳо мувофиқанд. Масалан, муаллиф хангоми тахлили глюконати калсий ва ацетати калсий дар махлули шустани калсий сутунхои асосиро истифода кардааст. Ҳарду моддаҳо дар λ=210nm ҷавобҳои қавӣ доштанд ва дараҷаи ҷудошавӣ ба 3,0 расид; муаллиф ҳангоми таҳлили моддаҳои марбут ба глюкоза сутунҳои гидрогениро истифода бурд. Якчанд моддаҳои асосии ба ҳам алоқаманд - мальтоза, мальтотриоза ва фруктоза - ҳассосияти баланд дар зери детекторҳои дифференсиалӣ доштанд, ки маҳдудияти муайянкунӣ то 0,5 ppm ва дараҷаи ҷудошавӣ 2,0-2,5 буд.
Сутунҳои мубодилаи анион асосан барои таҳлили моддаҳои анионӣ, аз қабили кислотаҳои органикӣ ва ионҳои галоген мувофиқанд; сутунхои катионхои пуркувват кобилияти мубодилаи ионй ва интихобй баландтар доранд ва барои чудо кардан ва тахлили намунахои мураккаб мувофиканд.
Дар боло танҳо як муқаддима ба намудҳо ва доираи татбиқи якчанд сутунҳои маъмулии хроматографияи моеъ дар якҷоягӣ бо таҷрибаи худи муаллиф мебошад. Дар барномаҳои воқеӣ дигар намудҳои махсуси сутунҳои хроматографӣ мавҷуданд, ба монанди сутунҳои хроматографии калонҳаҷм, сутунҳои хроматографии хурд, сутунҳои хроматографияи наздикӣ, сутунҳои хроматографии бисёрмодарӣ, сутунҳои хроматографияи моеъи баландсифат (UHPLC), сутунҳои хроматографияи моеъи суперкритикӣ ( SFC) ва ғайра дар соҳаҳои гуногун нақши муҳим мебозанд. Навъи мушаххаси сутуни хроматографӣ бояд мувофиқи сохтор ва хосиятҳои намуна, талаботи ҷудокунӣ ва дигар мақсадҳо интихоб карда шавад.
Вақти фиристодан: июн-14-2024